Молекула-диверсант. Учёные МГУ нашли причину тяжёлого течения COVID-19

Примерные соотносительные размеры иммунных клеток, бактерий и вирусов. Автор слайда: Дмитрий Купраш, сотрудник кафедры иммунологии Биофака МГУ (адаптировано)

Команда Андрея Круглова изучала кровь и слизь из бронхов пациентов с тяжелым течением коронавирусной инфекции. Проанализировав клетки, отвечающие за приобретенный иммунитет, ученые выяснили, что на ранних и поздних стадиях болезни преобладают разные типы антител. Круглов и его коллеги нашли молекулу, предположительно отвечающую за тяжелое течение COVID-19 — ею оказалась давно известная TGF-β. Именно она, по мнению биологов, вызывает фиброз (уплотнение) легких, а главное — дает команду иммунным клеткам перестать выделять одни антитела и начать выделять другие.

Работа команды Круглова представлена пятью важными выводами о течении болезни. Каждый — сделан на основе научных экспериментов. Первая часть работы связана с анализом иммунных клеток крови.

Что такое клеточный иммунитет, и какой еще иммунитет бывает?

Иммунитет (от лат. immunitas — «освобождение, независимость») — способность организма распознавать и удалять «чужое», а также запоминать встречу с ним. Разделяют иммунитет клеточный и гуморальный (лат. humor — жидкость, «жидкий иммунитет»). Клетки видны под микроскопом, а молекулы — нет, они растворены в крови, как сахар в чае. Когда иммунная клетка «поедает» чужака — работает клеточный иммунитет. Когда иммунная клетка вырабатывает антитела против чужака — работает гуморальный иммунитет.

Андрей Круглов анализировал оба типа иммунитета, причем в динамике: у недавно заболевших людей и у тех, кто пробыл на интенсивной терапии больше недели. Кажется очевидным, что болезнь протекает тяжело, если иммунитет «не справляется» (то есть иммунный ответ недостаточен). На самом же деле тяжелое течение заболевания может случаться и, наоборот, из-за слишком сильной реакции иммунитета — она тоже приводит к поражению тканей. Пример тому — описанный врачами цитокиновый шторм (подробнее — в лекции физиолога МГУ Вячеслава Дубынина).

— Как правило, недостаточный иммунный ответ бывает у людей старшего возраста, — объясняет Андрей Круглов, — это происходит из-за многих факторов. Это серьезная проблема биомедицины, потому что по этой же причине может быть снижен и ответ на вакцинацию.

Антиген и антитело — ключ и замок

Антитела вырабатываются в организме в ответ на появление чужеродных частиц. Но важно понимать, что взаимодействие антиген-антитело — это один из фундаментальных принципов, за изучение которого присуждена не одна Нобелевская премия. Не говоря уже о том, что рутинные методы анализа в медицинских лабораториях также построены на нем.

Антитела, или иммуноглобулины — это белки в форме буквы «Y», на двух вершинах которых есть точки связывания, которые напоминают замок — подойти к ним может только ключ определенной формы и никакой другой. Или это может быть дубликат. Например, если «шип» коронавируса — это ключ, то вакцину можно рассматривать как дубликат ключа. Белок «шипа» в этом случае — антиген. 

У одной молекулы антитела есть две точки связывания с конкретным антигеном. Оказавшись рядом, они обязательно свяжутся. Например, антитело может подходить для белка «шипа» коронавируса

Антиген (дословно «генератор антител») — это вещество, которое «заставляет» клетку вырабатывать антитела. Так, если ввести антиген в кровь — в ней выработаются антитела, из которых можно сделать препарат для лечения инфекции, для которой характерен такой антиген. Именно на этом эффекте основан первый в мире препарат для лечения COVID-19, зарегистрированныйв России 1 апреля 2021 года. 

Антитело подходит к антигену, как ключ к замку, поэтому при встрече они безошибочно связываются. На этом принципе основаны многие методы экспериментальной науки и медицинской практики

Взаимодействие между антигеном и антителом используют, например, для выявления какого-то вещества. Для этого в пробирку добавляют антитела к этому веществу. Если вещество в пробирке есть, антитела свяжутся с его молекулами — и эта реакция будет видна невооруженным глазом — см. картинку. 

Если нужно проверить, есть ли в пробирке какое-то вещество, можно поместить в нее антитела для этого вещества. Если вещество (антиген) есть, то мы увидим реакцию связывания в виде кольца

Три важных класса антител — все они изучены в работе Андрея Круглова в контексте COVID-19

Многим из нас в период пандемии приходилось сдавать кровь для анализа на антитела. При этом определяют разные классы антител. Одни, иммуноглобулины M (IgM), выделяются иммунными клетками при первом контакте с чужеродным антигеном. Другие, IgG, сохраняются после болезни, они отвечают за ответ на инфекцию во всем организме. Это используют при интерпретации результатов. 

Результат анализа крови на антитела к COVID-19. У пациента не выявлены IgМ — значит, прямо сейчас он не болеет. Но выявлены IgG — они сохраняются дольше, чем IgМ, хотя все равно могут «исчезнуть» через несколько месяцев. Возможно, этот пациент перенес инфекцию в бессимптомной или легкой форме

При этом антитела, вырабатывающиеся сразу — IgM — крупные, как если бы 5 молекул IgG встали в один хоровод. Такая большая молекула не проходит некоторые барьеры — например, от матери к плоду. 

Антитела (они же иммуноглобулины) разных классов. Источник: kardiobit.ru (адаптировано)

А третий важный класс антител — IgA. Когда они в крови, они путешествуют по одному. Но в минуту опасности — например, когда вирус попадает на слизистую оболочку носа — эти антитела объединяются в пару и выходят из крови «на передовую» — то есть на слизистые оболочки.

Первая часть работы Андрея Круглова. Анализ крови: встречаем клетки по одежке

— Мы не вирусологи — мы иммунологи, — говорит Андрей Круглов о начале работы. — Когда началась первая волна эпидемии, мы получили разрешение на работу с пациентами и определили для себя три проекта. В статье, о которой мы говорим, опубликованы результаты первой работы — о тех клетках иммунитета, которые производят антитела. Второй проект — про другие клетки иммунитета, которые просто «съедают» опасный объект. Над третьим проектом — о влиянии микробиоты кишечника на течение инфекции COVID-19 — мы работаем прямо сейчас.

На первом этапе ученые исследовали кровь пациентов с тяжелой формой коронавирусной инфекции.

— Мы изучали как сами иммунные клетки крови, так и их «телеграммы» — молекулы, в которых иммунные клетки отправляют информацию друг для друга, — продолжает Круглов. — Анализируя эти «телеграммы», можно оценить иммунную реакцию — например, как мы анализируем тексты из СМИ, чтобы понять, что происходит в мире.

Исследование проводили в Берлине, в сотрудничестве с немецкими учеными. Мы взяли образцы крови у девяти пациентов с тяжелым течением инфекции и у троих здоровых добровольцев. Из каждого образца нужно было получить по несколько тысяч иммунных клеток и отделить их от всех остальных. 

Если пробирку с кровью долго и с большой скоростью вращать, она разделится на три части

В крови есть много разных клеток, выполняющих разные функции — в этой работе изучались только иммунные клетки. Но иммунные клетки тоже бывают разные: их можно сравнить с вооруженными воинами, разведчиками. А какие-то клетки можно рассматривать как военных корреспондентов, так как по их «документам» можно получить представление о ходе боевых действий и характере противника.

Команда Андрея Круглова исследовала именно такие иммунные клетки. Чтобы выделить их из образца крови, использовали принцип взаимодействия антиген-антитело — но усовершенствованный так, чтобы клетки, с которыми связалось антитело, можно было легко отделить от всех остальных. Обычно для этого к антителам прикрепляют какую-то метку — например, которая будет светиться в определенных условиях. Это как приклеить светоотражающую пленку на куртку и рюкзак школьника. В итоге получается красивое микроизображение — минус в том, что мы не можем «взять» эти клетки. 

Метод меченых антител. К антителу прикрепляют метку, которая светится в определенных условиях

В этой работе поступили интереснее — в качестве меток использовали металлические шарики. Антитела с этими шариками «нашли» клетки с частицами, к которым они подходят, и связались с этими частицами — таким образом, нужные клетки были «помечены» шариками. После этого их можно собрать на сильный магнит. Этим занимался непосредственно Андрей Круглов, работая с опасным материалом — инфицированной кровью. Затем то, что «примагнитилось» (шарики с клетками) отбирают, магнитное поле выключают — и клетки готовы для дальнейшей работы.

Далее нужно было определить, какая клетка что делает, и в соответствии с этим разделить их на группы. Вручную распределить десятки тысяч клеток невозможно — это делает специальная программа. Она распределяет клетки «по одежке» — как если бы, например, нужно было распределить десятки тысяч фотографий людей, отделив одетых в милицейскую форму от облеченных в камуфляж (компьютеру под силу такая задача!). Так же по «одежде» клетки примерно понятно, какую функцию она выполняет.

Проанализировав все «телеграммы» и «документы» каждой клетки, программа выделила шесть групп и выдала результат в графическом виде, где группы представлены «облачками» разных цветов.

— Мы не задаем количество групп, на которые нужно разделить клетки, — поясняет Андрей Круглов, — программа сама находит закономерности и решает, какие параметры важно учесть, а какие — нет. В результате мы получили шесть кластеров клеток и смогли описать, какие клетки характерны для болеющих COVID-19. 

Компьютер на основе полученной базы данных распределил клетки на шесть групп. Получается график-карта, на которой каждая клетка обозначена точкой. Чем больше отличий между клетками, тем дальше соответствующие им точки расположены друг от друга. А если клетки во многом похожи, то программа располагает точки рядом. В результате получилось 6 разноцветных «облачков» — 6 групп похожих клеток

Таким образом, в результате первой части работы была получена характеристика клеток, найденных в крови пациентов, в течение длительного времени находившихся на интенсивной терапии — и доказано при сравнении с кровью здоровых людей, что эти характеристики связаны с инфекцией COVID-19.

Так как организм — живая система и все ее элементы постоянно меняются, было решено исследовать иммунный ответ в динамике. Например, было показано, что через неделю от начала заболевания состав клеток меняется — значит, активируются другие механизмы иммунного ответа.

Что меняется, когда человек тяжело болеет дольше недели? Новые функции известной молекулы

Второй важный вывод, сделанный учеными — это открытие молекулы, которая отвечает за тяжелое течение COVID-19. Эта молекула, TGF-β («ти-джи-эф-бета»), известна и изучается давно; она играет роль во многих процессах в организме — мы не будем подробно это описывать. Ее название в переводе с английского означает, что она участвует в создании генетического кода (подробнее об этом — в статье о «ножницах для генома»). TGF-β выделяют разные клетки: в крови, в кишечнике, в дыхательных путях.

Изменение состава клеток в крови пациентов, длительно болеющих COVID-19, тесно связано с изменением состава «молекул-телеграмм», при помощи которых иммунные клетки передают информацию и команды друг другу.

Так, клетки, на начальных стадиях болезни выделявшие IgM (как мы помним, это антитела, которые есть у тех, кто болеет прямо сейчас), начинают выделять IgG (антитела, свидетельствующие либо о поздней стадии, либо о том, что человек уже переболел). Как оказалось, связаны такие переключения именно с молекулой TGF-β, влияние которой на иммунную реакцию с течением болезни становится все значительнее. Она дает команду иммунным клеткам: «Не нужно выделять IgM! Нам нужны IgG!».

Так исследование команды Андрея Круглова открывает возможность лечения COVID-19 с помощью блокирования TGF-β — например, при помощи антител к этой частице. Да-да, принцип антиген-антитело позволяет не только наглядно выявлять какие-то частицы, как мы показали в начале — антитело именно блокирует молекулу (антиген), с которой связалось! Как если человек пишет текст, но приходит его давний друг (антитело) — и уже не до работы, нужно пообщаться. Так работают некоторые лекарства.

Кроме того, как отмечает Андрей Круглов, можно не «обезвреживать» готовые молекулы TGF-β, а блокировать их выработку на начальных этапах. В этой работе ученые никак не блокировали молекулу — но обозначают в заключении намерение провести такие эксперименты в дальнейшем.

— Обычно антитела к TGF-β используются при работе с онкологическими заболеваниями или склеродермией (редкое аутоиммунное заболевание, дословно «сухая кожа» — «ТД»), — поясняет Андрей Круглов.— Есть небольшая компания в Латинской Америке, которая занимается поиском возможности применения антител к TGF-β при тяжелом COVID-19. Важно убедиться, что это безопасно — может быть, сначала на хомячках попробовать: такие эксперименты уже готовятся. Мы тоже планируем провести клинические испытания таких препаратов, но пока нет конкретики — где именно и с кем.

То есть, такие препараты — антитела к TGF-β — есть, но их еще не использовали именно при COVID-19. А, как мы знаем из статьи о Спутнике V, сначала проверяют безопасность, потом — эффективность.

— Самое простое, что можно сделать — это проверить безопасность препарата» — говорит Андрей Круглов.

Слизь из бронхов — показатель местного иммунитета

TGF-β была найдена в легких пациентов с COVID-19, а также в легких погибших от этого заболевания. Тут она способствует активации местного иммунитета — как мы помним, среди антител есть способные объединяться в пару IgA. Они объединяются для выхода «на передовую», то есть создают местный иммунитет — защиту на слизистых оболочках.

— Когда мы нашли TGF-β, — рассказывает Круглов, — надо было понять, какие клетки ее выделяют. Вся работа была распределена: собирали жидкость из легких, привозили, сортировали, секвенировали («читали телеграммы» — «ТД»), анализировали — такой поток. Клетки, выделяющие TGF-β в легких, были подробно описаны — описание будет понятно для врачей, которые смогут сделать выводы на основе этих данных. Это не те клетки, что анализировали в начале. 

Бронхоскопия (др.-греч. σκοπέω — «наблюдаю») — процедура, при которой можно увидеть бронхо-легочную ткань, а также при необходимости взять образцы слизи из бронхов

Сравнивали разных пациентов: в одной группе были страдающие тяжелым течением COVID-19, в другой — пациенты с пневмонией, не связанной с коронавирусом. Таким образом, сравнение было не со здоровыми, а с другой болезнью — но это не является основанием для сомнений в результатах.

— Для лечения пациентов с COVID-19 их интубируют (вводят специальную трубку в трахею — «ТД»), — объясняет Андрей Круглов, — поэтому провести им бронхоскопию не так проблематично — все происходит параллельно. А здоровым людям в Германии на законодательном уровне нельзя делать бронхоскопию даже при согласии добровольца. Я готов был провести на себе, но доктора отказали, потому что запрещено. Поэтому группой сравнения были пациенты с пневмонией.

Несмотря на значимость сделанных открытий, работа команды не является крупным исследованием ввиду малой выборки. Однако полученных результатов достаточно для сделанных выводов, и это не умаляет ценности проделанной работы.

Микробиота — дружелюбные соседи

Еще одно перспективное направление, над которым работает Андрей Круглов, — изучение состава микробов кишечника. Наш организм состоит из клеток, но иммунологи МГУ утверждают, что из всех клеток, находящихся в нашем теле, собственно нашими являются только 10%. Остальные 90% — это микробы. Например, бактерии в нашем кишечнике помогают переваривать пищу, без них мы не можем усваивать витамины. Так, нормальная микробиота участвует в «настройке» иммунной системы. 

Бактерии кишечника. Автор слайда: Сергей Недоспасов, сотрудник кафедры иммунологии биофака МГУ

Сейчас команда Андрея Круглова готовит к выпуску статью о взаимном влиянии микробиоты кишечника и коронавирусной инфекции.

— Когда пять-шесть человек вместе работают, — размышляет ученый, — это постоянное взаимодействие, и в этом случае уже трудно говорить о том, чья изначально была идея. Это иллюстрация того, почему в науке не должно быть границ, и как коллаборация заинтересованных людей очень быстро приводит к результату: работу, о которой мы говорим, мы смогли сделать за четыре месяца, хотя обычно такие проекты занимают около четырех лет.